طراحی و سنتز نانوبیوکونژوگه کوانتوم دات - ارگانوفسفره هیدرولاز در تشخیص سموم ارگانوفسفره

در این تحقیق، ما یک حسگرزیستی جدید بر اساس یک بیوکونژوگه شامل نانوکریستالهای نیمه هادی کوانتوم دات و آنزیم ارگانوفسفره هیدرولاز را برای شناسایی ترکیبات ارگانوفسفره شرح می دهیم. آنزیم ارگانوفسفره هیدرولاز(oph) که یک آنزیم باکتریایی می باشد، با وزن مولکولی 72 کیلودالتون و قابلیت هیدرولیز تعداد زیادی از ترکیبات سمی از باکتری سودوموناس جداسازی و شناسایی شد. سلولهای باکتری در محیط نمکی براث حاوی دیازینون به عنوان منبع کربن در دمای 32 و دور 180 به مدت 1 الی 2 هفته رشد یافتند. کلونی با بیشترین قابلیت هیدرولیز سم به عنوان باکتری مورد نظر انتخاب شد. بعد از حل کردن دیواره سلول باکتری توسط سونیکاسیون و سپس سانتریفیوژ با محلول pmsf و بافر تریس hcl با8 ph=سپس رسوب گذاری با استفاده از نمک سولفات آمونیوم اشباع60% انجام شد. بعد از سانتریفیوژ، محلول رویی و رسوب به دست آمده توسط دستگاه اسپکتروفتومتری با میزان جدب نوری در 410 نانومتر مورد سنجش فعالیت آنزیمی قرار گرفت. سپس برای تخلیص بیشتر آنزیم از ستون کروماتوگرافی تعویض یونیb 6 deae-sepharose cl- استفاده شد. غلظت آنزیم با استفاده از روش برادفورد تعیین شد. در نهایت برای ارزیابی میزان خلوص آنزیم الکتروفورز sds-page نیزانجام شد. نانوکریستالهای نیمه هادی یا کوانتوم داتها(cdte,cdte/cds ) با استفاده از روش رفلاکس با احیاء پودر تلوریوم و تحت جریان گاز ازت در آزمایشگاه سنتز شد. در این روش از پایدارکننده تیوگلیکولیک اسید و احیا کننده سدیم بور هیدرید استفاده شد. سپس شدت فلورسانس کوانتوم داتها با استفاده از دستگاه اسپکتروفلوریمتری با طول موج تحریکی 325نانومتر و طول موج نشری 600-400 نانومتر تعیین شد. طول موج نشری کوانتوم دات استفاده شده در بیوسنسور 545 نانومتر می باشد. آنزیم oph از طرق پیوند الکترواستاتیک بین بار منفی سطح کوانتوم داتها و بار مثبت انتهای آمین پروتئین اتصال یافت. مطالعات طیفی فلورسانس نشان داد که با افزودن پاروکسون و دیازینون به عنوان سوبسترای آنزیم به نانوبیوکونژوگه oph/qd شدت فلورسانس کاهش یافت. با افزایش غلظت پاروکسون و دیازینون شدت فلورسانس بیوکونژوگه به میزان بیشتری کاهش یافت. این نتایج نشان داد که کاهش فلورسانس در نتیجه تغییرات ساختار سوم آنزیم اتفاق می افتد. این ویژگی ها باعث می شود که بیوکونژوگه حاصل به عنوان یک بیوسنسور مطلوب عمل کند. و اثر یون های فلزی و دترجنت بر روی فعالیت آنزیم آزاد و نانوبیوکونژوگه مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که کبالت بیشترین اثر مثبت و sds بیشترین اثر منفی را بر روی فعالیت آنزیم دارد.